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【热门应用】乳清蛋白(WPI)在多检测器SEC应用表征

发布时间:2022-09-14      点击次数:162


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乳清蛋白(WPI)在多检测器SEC应用表征




#本文由马尔文帕纳科应用专家冯慧庆供稿#

2022 


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什么是乳清蛋白?它有什么作用?


乳清是奶酪制作过程中的副产品,而乳清蛋白(WPI)是一种膳食补充剂和食品成分,是从牛奶中分离出来的。它含有很高比例的纯蛋白质,纯度可达90%以上,几乎不含乳糖、碳水化合物、脂肪和dan固醇。


乳清蛋白具有很高的营养价值,已成为各种保健食品中功能性成分的重要来源。它被广泛用于婴儿配方奶粉中,为最佳生长发育提供天然的氨基酸来源,也经常在食品工业中用作乳化剂和稳定剂。WPI在运动员中也很受欢迎,因为它能够被非常迅速地消化,并帮助锻炼后的身体从分解代谢状态恢复到合成代谢状态。据有些应用表明,WPI可能具有抗炎或抗癌的作用。


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乳清蛋白是由什么组成的?


乳清蛋白由以下四种主要成分组成:


β-乳球蛋白

β-乳球蛋白是牛和羊乳清蛋白的主要成分,也存在于许多其他哺乳动物中。然而,它不存在于人类母乳中。大约85%的牛奶过敏性儿童在3岁前就不会过敏了,但其余15%的儿童仍对牛奶过敏。牛β-乳球蛋白是牛乳中的主要过敏原,因此乳制品生产商需要证明β-乳球蛋白的存在或不存在,以确保其标签满足牛奶过敏症的要求。β-乳球蛋白是一种相对较小的蛋白质,由162个氨基酸组成,分子量为18.4kDa,在生理条件下主要以二聚体形式存在。

α-乳蛋白(α-lactalprotein)

α-乳蛋白(α-lactalprotein)是一种存在于几乎所有哺乳动物乳汁中的蛋白质,与乳糖的产生有关。分子量为14,178 kDa。

血清白蛋白

血清白蛋白是由肝脏产生的,其主要功能是作为血液中类固醇、脂肪酸和甲状腺激素的载体蛋白,并通过增加肿瘤性压力在稳定细胞外液容量方面发挥重要作用。血清白蛋白是一种球形水溶性蛋白质,分子量约为65 kDa。

免疫球蛋白(Ig)

免疫球蛋白(Ig),也被称为抗体,被免疫系统用来识别和中和异物,如细菌和病毒。在胎盘哺乳动物中有五种抗体亚型,即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。典型的免疫球蛋白分子量为150 kDa。


在本文,使用OMNISEC多检测器系统对WPI乳清蛋白样品进行表征。对混合物中的4种主要成分进行了分离,并分别进行测定。


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乳清蛋白样品表征方法


使用马尔文帕纳科的OMNISEC多检测器系统对乳清蛋白样品进行分析,使用示差检测器(RI)、紫外检测器(PDA)、7°角光散射+90°角光散射(LALS/RALS)和粘度(IV)检测器。样品用马尔文P柱(300×7.8 mm ID)分离,1×P4000和1×P3000柱分离。


流动相为0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液,每次进样总物质约500μg。用OMNISEC软件中的共聚分析计算对色谱图进行分析。所有蛋白的dn/dc是0.185。


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OMNISEC分析结果

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色谱峰3的分子量为33 kDa,质量分数为75%,与β-乳球蛋白相对应,清楚地表明它是乳清蛋白中的主要成分。β-乳球蛋白单体的分子量为18.4kDa,但它在活性状态下以二聚体的形式存在,因此,尽管略有差异,但33 kDa的峰仍然表明是二聚体。


α-乳蛋白(色谱峰4)的分子量为15 kDa,与理论值相符。一个有趣的发现是,α-乳蛋白的RI峰(测量浓度)的峰高不到β-乳球蛋白的一半,而两者的紫外信号高度非常相似。这表明α-乳蛋白在280nm处的消光系数高于β-乳球蛋白。


根据分子量将70K峰和150K峰分别认定为血清白蛋白和免疫球蛋白。所有四个峰的Pd值都很小,这与预期一致,这是因为蛋白质总是有一个窄的Pd值。


从分离机理来看,流体力学半径值随保留体积的增加而减小,证实了低分子量蛋白质的尺寸较小。特性粘度值也随着分子量的增加而降低,但不是线性的,反映了蛋白质结构的不同。β-乳球蛋白二聚体的特性粘度最清楚地说明了这一点,尽管其分子量是α-乳球蛋白单体的两倍,但仅比其值高出15%。这表明二聚体β-乳球蛋白的结构比α-乳蛋白更致密。


聚集体

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在10-12mL的低保留体积下,LALS和RALS检测器均出现单峰,而RI和UV检测器则完全没有峰。RI和UV信号与浓度成正比,因此该峰的浓度一定很低。


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从瑞利散射方程得知,光散射强度与分子量乘以浓度成正比,因此分子量必须非常大才能在光散射图中显示色谱峰信号。该聚集体以较低的保留体积洗脱出来,粘度检测器中也没有峰。这表明这些聚集体非常致密,具有较低的特性粘度,而不是纤维状或其他结构,因此粘度检测器没有检测到色谱峰信号。


实验结论

Conclusion


本文数据表明,OMNISEC多检测器系统可以用来表征复杂的蛋白质混合物,如WPI中的蛋白质。本文对乳清蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、β-乳球蛋白和α-乳蛋白的浓度、分子量、流体力学半径和结构进行表征,通过一次上样测试,就可以得到全面的数据,测试过程简单、高效、准确。


同时,一些蛋白质多聚体也可以清晰地被光散射检测器识别出来,尽管这些聚集体的浓度很低。OMNISEC多检测器系统在此类应用中的拓展使用使其成为食品和营养方面或其他与蛋白质相关的应用(如生物制药研究)的理想选择。



OMNISEC

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OMNISEC 尺寸排阻色谱仪

OMNISEC是个多检测器SEC系统,包括示差检测器(RI)、紫外检测器(UV)、光散射检测器(LS)和粘度检测器(IV)。可以用于高分子你、天然高分子以及蛋白质的分析:


  • 灵敏的光散射检测器

  • 极限稳定性,针对低浓度样品具有更高的灵敏度

  • 自平衡粘度计检测器

  • 宽紫外/可见光波长范围,应用更广泛

  • 更人性化的设计,运用简便、直观