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DLS+SEC+DSC多种技术结合,助力AAV基因递送载体的表征

发布时间:2022-09-20      点击次数:452


AAV 





DLS+SEC+DSC多种技术结合

助力AAV基因递送载体的表征



部分疫苗通过引入mRNA来触发对SARS-CoV-2冠状病毒刺突蛋白的免疫反应。递送mRNA的载体之一有腺相关病毒(AAVs)。有很多生物物理的技术可以为候选疫苗的研究和开发提供新的见解。比如光散射技术可用于测量病毒衣壳的浓度,比ELISA方法更迅速;色谱技术可用于测量空壳率;完整衣壳可在微量热技术中显示出不同的特征。



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DLS 动态光散射技术


DLS可用于样品关键生物物理参数的测量,或用于筛分优质、稳定的的样品和那些受污染、有聚体的样品。通过Zetasizer Ultra纳米分析仪的多角度动态光散射技术(MADLS),不仅可以在几分钟内测量样品的流体动力学直径和粒径分布(包括聚集体),还可以测量每个群体的颗粒浓度。此外,仪器新的自适应相关算法提高了测量精度、重现性,以及对异物或大的聚集体的包容度。

图1. Zetasizer Ultra纳米粒度仪和DLS测量粒径分布的案例


使用MADLS技术

进行AAV载体大小和浓度测量


本文用Zetasizer Ultra分析了3个AAV样品。浓度结果与基于衣壳ELISA的病毒滴度测定的结果进行对比。


采用多角度动态光散射(MADLS)技术测量3个AAV样品的颗粒大小分布,重复测量3次,结果如下。显示有少量样品团聚。标准品(A)发生的团聚比AAV样品(B和C)更多一些。同时分别测得了AAV单体和团聚体的颗粒浓度,结果见图D-F。表1中对比了MADLS方法和衣壳ELISA法测得的浓度结果。AAV样品的RSD<15%,ATCC AAV2参考标准品的RSD 45%。


图2. 颗粒大小分布的3次重复测量结果:图A-ATCC AAV2标品,图B-AAV样品1,图C-AAV样品2。图D-F的颗粒浓度结果一一对应图A-C中的样品。


采用AAV衣壳ELISA方法进行测量


酶联免疫吸附试验 (ELISA) 是病毒滴度或衣壳浓度的标准测量方法。我们将MADLS浓度数据与已有的衣壳ELISA方法测量的数据进行比较。单分散rAAV样品(RSD 13-15%)与ELISA方法测量的rAAV衣壳滴度几乎没有差异。


这些结果表明了完整 rAAV 衣壳的无标记分析方法与其他常见滴度测定方法是互补的。发生团聚的多分散rAAV样品的RSD高达45%。我们认为这是因为多分散样品的尺寸精度较低。


表1. 衣壳ELISA测得的浓度数据和MADLS测定的颗粒浓度数据,3个样品分别是ATCC AAV2参考标准品,样品1,样品2。浓度数据单位是颗粒数量/ml。n表示3次重复测量中观察到该峰的次数。n/a表示未观察到该峰。


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SEC尺寸排阻色谱技术


多检测器尺寸排阻色谱(SEC)可用于多种rAAV属性的测量,如衣壳滴度、绝对分子量、聚集体、寡聚体、片段分布和空壳率。


市售rAAV5样品(Virovek,US)含有空衣壳和完整衣壳的混合物。完整衣壳rAAV样品Mw是4.49x106 g/mol,蛋白质含量86%,ssDNA Mw 6.13x105 g/mol,完整衣壳AAV占比78.1%,总滴度7.48x1013(单体和聚集体)。空rAAVs Mw小一些,3.84x106 g/mol,总滴度5.91x1013(单体和聚集体)。当空衣壳和完整衣壳以已知比例添加时,测得的空壳率与预测结果高度相关,R2高达0.99。


图3. OMNISEC系统和示例色谱谱。示例中样品为空rAAV单体、二聚体、高聚体和片段的混合物。针对单体峰进行空壳率分析。


图4. OMNISEC空壳率分析结果。预估值(表格第三列)来自添加的空衣壳和完整衣壳比率,调整到100%。基于Mw得到完整衣壳占比 78.1%。计算值(表格第四列)基于单体峰的Mw值得到。


3

DSC 差示扫描量热技术


差示扫描量热仪(DSC)可用于测量蛋白质、核酸和病毒衣壳的热变性和热稳定性。该技术测量溶液中分子热诱导的结构变化的焓变(ΔH)和结构转变温度(Tm)。该测量方式直接、溶液相和非标记,不需要额外的荧光标记或抗体捕获。


空衣壳和完整衣壳rAAV5样品(Virovek, US)的PEAQ-DSC结果显示有多个转变温度(Tm),与衣壳分解(Tm1)和ssDNA熔融(Tm2)有关。此外,完整rAAVs在50度时显示出弱的热特征,而空壳rAAVs没有,这表示热诱导事件的发生可能与衣壳脱壳相关的完整rAAVs里的结构重组有关。


图5. MicroCal PEAQ-DSC自动系统和完整rAAV的DSC热图谱示例。图谱显示了明显的热转变温度(Tm)分别是89°和94°。红星号标注出早期的热转变发生在50°。



  总结  


1, 衣壳ELISA方法和MADLS方法测得的颗粒浓度结果的RSD≤15%。有团聚颗粒时RSD为45%。


2, 多检测器SEC色谱仪可用于测量空衣壳和完整rAAVs的纯度、寡聚分布和空壳率。


3, 使用DSC表征衣壳分解和ssDNA熔融时空衣壳和完整rAAVs的不同热转变和热稳定性行为。



Zetasizer Ultra


Zetasizer Ultra 纳米粒度及电位分析仪

Zetasizer Ultra 是快速而准确地测量颗粒和分子大小、颗粒电荷以及颗粒浓度的伴侣,其拥有用于高分辨率粒度测量切角度无关的多角度动态光散射(MADLS)技术可以更深入地展现样品的颗粒分布,电泳光散射(ELS)技术可用于测量颗粒和分子的Zeta电位,以显示样品的稳定性和/或团聚倾向性。可以用于rAAV 颗粒的粒径及衣壳滴度的表征。


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OMNISEC

图片

OMNISEC 尺寸排阻色谱仪

OMNISEC是个多检测器SEC系统,包括示差检测器(RI)、紫外检测器(UV)、光散射检测器(LS)和粘度检测器(IV)。可以用于表征和研究附着在脂质纳米颗粒颗粒递送载体上的药物量以及产品的分子量和结构。


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MicroCal PEAQ DSC

MicroCal PEAQ DSC差示扫描量热仪

差示扫描量热法(DSC)是一种功能强大的分析技术,用于表征和分析蛋白质和其他生物分子的热稳定性。


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