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【热点应用】高级多检测器SEC表征腺相关病毒载体的方法

发布时间:2021-12-27      点击次数:571

#本文由马尔文帕纳科应用专家冯慧庆供稿#
 
基因治疗是生物制药行业中一个快速增长的领域,通过基因治疗可实现疾病的治疗或预防。其中,重组腺相关病毒(rAAV)是目前基因治疗领域研究较多的一类病毒载体。
腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是微小病毒科(Parvoviridae)家族的成员之一,一般,研究中采用的重组腺相关病毒载体(Recombination adeno-associated virus, rAAV)是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体,由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等,rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。
目前,rAAV的准确定量分析和表征的难度是阻碍基因治疗快速发展的关键因素。我们常常需要对rAAV进行综合全面表征,比如衣壳数量、实心率、颗粒尺寸、聚集体比例等。传统情况,rAAV滴度和病毒载量采用ELISA、ddPCR、AUC和EM等技术进行测量。但这些方法通常费时费力,而且精确度不高。
本文通过GPC/SEC和多角度动态光散射(MADLS)两种分析技术分析rAAV5样品,展示了快速、准确和可靠地定量测量AAV的病毒滴度(AAV Titer)和实心率(% full AAV)的方法。
 
01仪器参数
OMNISEC GPC/SEC多检测器系统非常适合于生物医药行业,可用于全面表征rAAV样品。OMNISEC包含一个示差折光检测器(RI),紫外线全波长阵列检测器(UV-Vis 190-900 nm)和光散射检测器,仅需一次进样,可精确测量绝对分子量、聚集体比例、病毒滴度和实心率。
与传统HPLC不同,测量过程不依赖柱保留体积,也不需要一系列标样进行色谱柱校正。图1显示了使用OMNISEC测量的CQA关键质量参数。
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02检测方法
我们采用Empty和Full rAAV5两个样品作为分析案例。Full rAAV5 载有已知分子量为785 kg/mol的PFB-GFP ssDNA。经qPCR和ELISA测量方式可知,该样本的病毒滴度为2.5x1013
采用色谱柱P4000和P3000串联,对rAAV样品的进行色谱分离。由OMNISEC软件采集分析测试结果,其中硬件系统包含OMNISEC RESOLVE(包含泵、自动进样器和柱温箱)和OMNISEC REVEAL(包含示差、UV/PDA和直角90°/小角7°光散射检测器)。
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样品经过分离洗脱后,使用共聚物分析方法确定样品两种不同组分的浓度和分子量。计算方法如下:
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其中,ConcCapsid是衣壳浓度(mg/mL),NA是阿伏伽德罗数,Mwcapsid是衣壳的分子量(g/mol),ConcDNA是DNA浓度(mg/mL),MwSeqDNA是来自序列的ssDNA的分子量。因此,通过计算出的颗粒浓度,可以很容易地得出样品实心率的百分比。
 
03检测结果
案例一:
图2显示了Empty rAAV5的三检测色谱图。RI信号由红色曲线表示,260 nm紫外信号由紫色曲线表示,直角光散射(RALS)信号由绿色曲线表示。样品包含四个部分:单体峰保留体积(RV)在12.5ml,碎片在16ml ,二聚体在10.5ml ,聚集体在8.5ml 。使用共聚物分析方法,可以得到表1结果。
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单体的分子量为3.84×106g/mol。衣壳的理论分子量为3.8×106g/mol,证实分析结果与预期相符。
MW/Mn为分子量分布,描述了样品的分散性,单体和二聚体的值接近1,而聚集体和片段均显着高于1,表明在同一峰内有多个不同分子量的组分。
Fraction of Sample表示样品组分百分含量,单体所占百分比为84.7%。
Fraction of Protein显示了样品中衣壳的百分比,单体包含99.8%的衣壳。这证实了样本确实是Empty rAAV5。
最后Empty rAAV5样品总滴度为5.91x1013Vp/ml。
 
案例二:
第二个样品Full rAAV5的三检测器色谱图如图3所示。图中显示了与Empty rAAV5截然不同的色谱峰。分析色谱图可以看出,只包含两个不同的组分,其中单体峰,大概12.5ml RV处,包含Full 和Empty rAAV5的混合物,而聚集体出现在8ml RV处。测试结果见表2。
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对于主体的单体峰,计算出其混合物分子量为4.49×106g/mol,其中86%为衣壳。rAAV5的蛋白质组分的分子量为3.89×106g/mol,这与表1中Empty rAAV5 的数据一致。单体是总体的93.2%,样本的总滴度为7.48x1013VP/ml。其中单体包含78% Full rAAV5,22% Empty rAAV5。需要注意的是,这种分析方法假设样品要么是Full ,要么是Empty ,忽略部分装载或过度装载情况。
Zetasizer Ultra纳米粒度及电位仪可以使用MADLS方式快速确定病毒滴度。从OMNISEC获得的数据与Zetasizer Ultra的粒子滴度进行了比较,两种技术之间有很好的相关性,见图4。
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另外,本文将Full rAAV5和Empty rAAV5以确定比例混合,来对Full rAAV5样品进行分析。表3显示了每个样品的预期值和实际值Full rAAV百分比。图5显示了期望值和实际值之间有很强的相关性,证实了OMNISEC确定样品实心率结果的可靠性。

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为了进一步评估OMNISEC对rAAV样品准确表征能力,我们进行了rAAV5样品的热应力稳定性研究,同时,基于ZS Ultra对聚集体的*灵敏度,我们利用了ZS Ultra表征rAAV5聚集体的微小变化。测试条件是将rAAV5样品置于25oC到80oC之间进行测试。

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在不断加热过程中,在每个温度下测量rAAV5样品的粒径。在25oC和35oC之间,没有观察到粒径的变化。从35oC开始,可以观察到粒径开始增大,这表明样品开始发生变化(图6A)。30oC和45oC下的数据比较清楚地显示了这些样品之间的大小差异(图6B)。我们选择45oC条件,对OMNISEC进行进一步稳定性研究。
将rAAV5样品在稳定在45oC,分别在2min 、5min、10min和15min后,取样品到OMNISEC上测试。图7色谱叠加图显示样品发生了明显的变化,聚集体百分含量增加,单体浓度含量降低。表4显示MW在此潜伏期内保持稳定,单体峰中的AAV百分比也保持稳定。
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结论:
在这项研究中,我们展示了OMNISEC和Zetasizer Ultra在综合分析表征rAAV5样品的能力,以及将两者联合使用的应用价值。 
OMNISEC多检测SEC系统将示差折光检测器、紫外全波长检测器、光散射检测器集成一体化设计,具有更高的灵敏度和准确度,通过一次进样分析,可提供各种血清型AAV样品的绝对分子量、衣壳大小、滴度、实心率、聚集体、片段和样品稳定性等关键质量属性。虽然这些参数中很多都可以使用传统的生物化学方法来确定,但OMNISEC提供了更为简单、可靠的方法,正逐渐成为一种表征分析AAV通用的技术工具。