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【AAV热点应用】Zetasizer精准表征rAAV颗粒粒径及衣壳滴度

发布时间:2022-06-02      点击次数:349

腺相关病毒载体表征


腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)是微小病毒科(Parvoviridae)家族的成员之一。其直径约为20-26nm,含有4.7kb左右的线状单链DNA。重组腺相关病毒载体(recombination AAV, rAAV)则是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的,因其具有:安全性高、免疫原性低;宿主细胞范围广(对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力);体内表达时间长;血清型众多,且具有组织特异性等特点被广泛用于基因治疗、疫苗等研究、应用领域[1]。


在rAAV的生产工艺中,有无团聚体(aggregate),以及衣壳滴度(titer)的高低是重点考察的关键质量属性(CQAs)[2],Zetasizer纳米粒度仪通过对rAAV颗粒的粒径及衣壳滴度的表征,快速实现该CQAs的鉴定。


纳米粒度电位仪

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马尔文帕纳科 Zetasizer Ultra


01

材料和方法



将两种不同生产批次的rAAV分别用缓冲液稀释至合适的浓度,利用Zetasizer Ultra-Red (Malvern Panalytical Ltd.)以及小体积石英比色皿(ZEN2112)进行相应的粒径和滴度测定[3]。样品测试体积为20 µL,rAAV折射率、吸收率分别设置为1.45和0.001,缓冲液的散射光强度测定为80 kcps。


02

结果


通过多角度动态光散射(multi-angle DLS, MADLS)技术,我们分别对两种批次的rAAV粒度大小及分布进行表征(图1、3)。可以看到,批次1的rAAV只有一个粒径分布峰,其值大小为28.2 nm,说明体系中没有团聚体产生,而批次2的rAAV则呈现出3个粒径分布峰,分别位于28.2、150.9以及430.6 nm,这说明体系中除了rAAV单体,还有团聚体产生。


此外,基于MADLS技术得到的颗粒的准确粒径分布图,我们还能得到对应尺寸的衣壳滴度(图2、4)。

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参考文献

1. Mendell J R, Al-Zaidy S A, Rodino-Klapac L R, et al. Current Clinical Applications of in vivo Gene Therapy with AAVs. Molecular Therapy, 2021, 29 (2), 464-488.


2. Gimpel A L, Katsikis G, Sha S, et al. Analytical Methods for Process and Product Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus-based Gene Therapies. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2021, 20, 740-754.


3. Cole L, Fernandes D, Hussain M T, et al. Characterization of Recombinant Adeno-Associated Viruses (rAAVs) for Gene Therapy Using Orthogonal Techniques. Pharmaceutics, 2021, 13, 586.